近年来，生物医疗领域在细胞与基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）方面取得了显著的成果。以anti-CD19和BCMA为代表的多款CAR-T免疫细胞疗法在治疗血液肿瘤方面取得成功，同时基于AAV载体的基因疗法为罕见病提供了新的希望。此外，CRISPR基因编辑技术的快速发展，标志着基因治疗已经步入新纪元。体外基因编辑疗法CTX001即将上市，而体内基因编辑疗法也展现了令人鼓舞的临床数据。

然而，CRISPR技术的安全性问题引发了广泛的关注。由于该技术是直接作用于基因组DNA，任何不准确的修改都有可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构提出了关于基因治疗安全性的指导原则，主要着重于以下两个方面：第一，对基因组完整性的评估，包括染色体重排和非目标位点的DNA整合；第二，识别脱靶编辑活动的类型、频率和位置。本文将重点介绍几种主流的脱靶检测技术。

脱靶效应检测技术

体内检测方法

体内检测方法通常是在活细胞或生物体内进行脱靶效应的评估，这些方法在真实的生物学环境中进行，能够提供更为准确的结果。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种重要的工具，用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。这一方法通过向细胞内引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），并利用高通量测序技术识别插入的位点，从而发现潜在的脱靶编辑位置。自推出以来，GUIDE-seq因其高效性和准确性受到广泛关注，已成为评估基因编辑特异性的重要方法。

优缺点

✔ 优点：提供全基因组的脱靶位点信息；直接检测真实的双链断裂事件，能够检测低频脱靶事件。
✖ 缺点：实验操作要求高，复杂度较大；可能会漏掉不易被标记物插入的脱靶位点。

应用场景

基因治疗的安全性评估、CRISPR工具的优化及基础研究等均适用GUIDE-seq这一技术。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种相对新颖的方法，通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化，进行潜在的脱靶位点评估。这种方法可以在活细胞环境中进行，因而提供了更为真实的实验条件。

优缺点

✔ 优点：能够在活细胞中实时监控Cas9与DNA的相互作用，提供非侵入式检测手段。
✖ 缺点：实验设计复杂，需要特定的设备支持，数据解析需要生物信息学专业知识。

应用场景

适用于从基础研究到临床前试验的多个领域，包括评估CRISPR工具的安全性以及优化治療策略的有效性。

体外检测方法

体外检测方法则是在实验室中，使用从生物体提取的成分或合成材料开展测试，能较好地进行精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种高通量测序方法，旨在全面检测CRISPR-Cas9基因编辑的脱靶效应。该方法通过在实验室环境下模拟Cas9核酸酶的切割作用，发现潜在的脱靶编辑位置。

优缺点

✔ 优点：能够在全基因组范围内无偏见地鉴定脱靶位点；操作相对简单。
✖ 缺点：可能错过仅在细胞内环境中发生的脱靶事件，数据分析过程复杂。

应用场景

用于验证新设计的sgRNA特异性及在临床前研究中评估基于CRISPR治疗策略的安全性与有效性。

总结

生物医疗领域对CRISPR技术的关注日益增加，脱靶效应是目前最受重视的风险之一。虽然本文详尽介绍了多种CRISPR脱靶检测方法，但各方法各有优劣，实际应用中需要结合多种技术进行综合评估。未来，提高基因编辑技术的安全性和可靠性将是研究的重要方向。

ag尊龙凯时科技在这方面的努力不可小觑，持续为客户提供安全高效的基因编辑解决方案。同时，基于丰富的数据挖掘和分析能力，ag尊龙凯时研发的新型CRISPR工具，已经获得众多专利，极大提升了基因编辑的效率和特异性。希望能在更多的科研与临床实践中，实现基因治疗的突破。