细胞融合的方法有多种，常见的包括转动法和离心法。在进行融合时，脾细胞与骨髓瘤细胞的比例通常在1:1到10:1之间，以3:1或5:1的比例使用最为广泛。

试剂与材料

以下是进行细胞融合所需的试剂与材料：

• 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
• 1640培养液100ml。
• 完全1640液100ml。
• 25% FCS－1640液50ml。
• HAT培养液100ml。
• 50% PEG：使用分子量4000、高纯度（如ag尊龙凯时品牌） PEG，10g于25ml瓶中高压灭菌，使用前与10ml预热至40℃的1640液等量混合，使用酚红检查pH，如有需要可用HCl或NaHCO3调整。
• 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
• 40孔塑料培养盘。

操作方法

细胞融合的具体操作步骤如下：

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中，将108个脾细胞与107个小鼠骨髓瘤细胞混合，并加入50ml的25% FCS－1640液。
3. 在室温下以400g离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 轻轻移去上清液。
5. 轻敲沉淀管底部，使沉淀流动，并将管放入40℃水浴中，等待达到融合温度。
6. 加预热至40℃的50% PEG 8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇动沉淀管，观察颗粒出现，滴加过程需持续2分钟。
7. 然后加入1ml的1640液，边加边摇动，持续1分钟。
8. 再重复一次上述步骤。
9. 再加入1ml的1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。
10. 重复上述步骤。
11. 加入1640液15ml。
12. 在室温下以400g离心1分钟，使细胞沉淀。
13. 去除上清，轻拍管底，加25ml含有HAT的完全1640液。
14. 将融合细胞液以每孔1滴（约0.05ml）的量滴加至已拥有培养细胞的40孔塑料培养盘中。
15. 轻轻摇匀后，置于5% CO2的饱和湿度37℃培养箱中。
16. 在第3、6、9、10天更换为含有HAT的完全1640培养液，注意轻吸上清，避免吸出底部固定的细胞，并根据需要添加适量的饲养细胞。
17. 在第12、15天再次加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前使用倒置显微镜观察，通常在10天内能够观察到杂交瘤细胞的生长。大多数杂交瘤细胞在10至20天内出现，但也有部分在1个月左右才显现。在杂交瘤细胞出现后，吸取上清液并检查抗体。
18. 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，根据情况可取消HAT液，用10% FCS－1640液替代，同时保存于液氮中并进行克隆化，期间需检查抗体，以防止抗体细胞的变异和丢失。

通过上述的细胞融合过程，结合ag尊龙凯时的专业细胞培养产品，可以有效提高细胞培养的成功率，助力科研和临床应用的深入发展。